非变性质谱即天然质谱法（native mass spectrometry），是一种用于分析蛋白高级结 构的质谱方法。使用这种方法，不改变蛋白 高级结构，因此可获得分析物在天然状态下 的结构信息[1] ，这是native ms的在蛋白药物分 析中的第一个重要特性：非变性分析特性。 之所以可以保持蛋白的天然结构，一方面是 因为在native ms分析中，避免了乙腈等有机 溶剂的使用，而是采用乙酸铵中性缓冲溶液； 另一方面，在离子化时，为了避免了高温及 高电压条件，而采用了如纳升静态喷雾等柔 和的离子化方式[2] 。
相对于常见的变性质谱法，在native ms 的原始质谱数据中，蛋白的离子信号移动到 了更高的质荷比区域。这是由于在常见的全 蛋白分子量测定中（变性质谱法），蛋白在 含有乙腈的缓冲液及高温高电压的离子化条 件下，其高级结构被破坏，而伸展开来，暴 露出了更多的可结合h+的部分，因此携带了更 多的电荷。对于单抗来说，采用变性质谱法，其质荷比主要分布于2000m/z至4000m/z，而 native ms 条件下 ， 则分布于 5000m/z 至 7000m/z区域（图1）。从图一可以看出，在 native ms图谱中，不但信号的分布区域位于 高质荷比区，更重要的是，由于所带电荷数 减少，信号分布变得疏离。在复杂样本分析 时，疏离的信号分布会降低信号相互覆盖的 可能性。这是native ms在蛋白药物分析中的 第二个重要特性：简化图谱特性。
在单抗药物相关分析中，native ms的非 变性分析特性，被用于cystine linked adc（利 用还原二硫键形成的抗体-药物偶联物）以及 抗体-抗原结合等分析；而native ms的简化图 谱特性则被可用于糖基化定量、双功能抗体、 混合抗体等分析项目中。
由于native ms中样品的质荷比远远高于 常见的质谱信号，因此要对质谱硬件进行特 殊设计。问世的exative plus emrtm质谱， 是以超高分辨质量分析器orbitrap(静电场轨道阱)为基础的，专为native ms分析需求所设计 的一款仪器 ， 其质荷比范围可覆盖至 20000m/z。exative plus emr以其超高分辨率、 信号基线分辨能力以及超强的稳定性，不但 被广泛应用在蛋白药物分析，甚至在分子量 高达80万da的蛋白复合体分析中都已被采用[3] （图2）。
除高质荷比范围采集能力外，去除粘附在 蛋白上的溶液分子及金属离子也是提高native ms图谱质量的必要条件。粘附分子或离子的 存在会造成蛋白质量变大的假象 [4] （图3）， 从而影响分析准确度。exative plus emr在离子 源以及hcd碰撞池，为去除粘附分子及离子做 了独特的专门化设计[3] 。不同于其他的高分辨 质谱，exactive plus emr允许用户设置一定的 hcd碎裂能量以去除粘附分子及离子；同时， 特有的emr mode具有automatically hcd gascontrol 功能，可对hcd碰撞池中的n2气压进 行调节。在exactive plus emr上通过协同优化 源内裂解能量 、 hcd 碎裂能量和 hcd gas control三个参数，可尽可能多地除去粘附分子 及离子。
随着单抗药物市场竞争及应对抗体抗药性 的需求，单抗-药物偶联物（antibody drug conjugate，adc）类药物已经成为新型抗体药 物开发的一个重要方向。在各种adc药物中， 通过还原单抗二硫键，将小分子药物连接到 半胱氨酸巯上而形成的cystine linked adc药物， 由于其较好的结构均一性及更稳定的化学连 接形式，已经成为adc药物开发的最重要方向。 但是，由于负责连接轻、重链的二硫键被打 开，单抗内各链间依靠非共价结合，因此， 此类adc药物的高级结构稳定性差。如果采用 常规的质谱方法分析其dar值（drug antibody ratio），各链会发生分离，导致分析失败。 而native ms的非变性分析特性，正适用于此。 图4为cystine linked adc药物adcetris进行dar 分析的原始质谱数据（adcetris是fda于2011 年批准的用于治疗霍奇金淋巴瘤以及复发性 间变性大细胞淋巴瘤adc药物）[4] 。图中分别 展示了去糖基化与保留糖基化非变性质谱数 据，可以看到，即使是在样品复杂程度巨大的含糖链adc药物的图谱，含相同小分子药结 合数量的单抗信号也都被清晰分辨，这就为 dar值的准确计算打下了坚实的基础。
native ms在单抗寡糖的含量测定分析中 具有独特的角度与优点（图5）。在常见的分 析方法中，首先是将糖链通过糖苷酶将寡糖 从蛋白中释放出来。被释放的寡糖将通过多 步处理，使其连接荧光基团。荧光基团的加 入是因为寡糖本身无光谱吸收，且离子化效 率非常低，不利于质谱分析。标记荧光基团 后，可使用荧光检测器分析，并提高其质谱 分析的离子化效率。但是荧光标记必须经过 多步复杂的样品处理操作，整个实验时间也 需要约2天时间。因此此种方法具有工作效率低，实验成本高，操作难度大等缺点。如果 操作经验不足，易造成重现性差等问题。特 别是对于含有唾液酸的寡糖，在样品处理时 容易丢失，造成实验分析失败。此外，在连 接了荧光基团的寡糖中，荧光基团只占了非 常小的一部分，对其寡糖离子化效率的提升 有限。这也是寡糖在进行液质分析时，采用 液相-荧光检测-质谱检测的原因（荧光信号主 要负责定量，质谱信号主要负责定性）。既 然荧光标记法具有如此多的不足之处，为何 其在单抗的寡糖分析中仍被广泛应用？归根 结底，无非是因为想克服寡糖检测信号的问 题。而单抗上的寡糖其实天然地携带了一个 可提升信号的标记基团——抗体肽链部分。抗 体分子量近15万da，而糖链分子量仅为3-4千
da左右。因此在质谱分析的离子化过程中， 单抗的肽链将起到决定性作用。rosati等的研 究，有力的证明了这一点：唾液酸含量是寡 糖离子化最大的影响因素，唾液酸越多，寡 糖离子化越差，因此会造成不同组成糖链的 离子化效率不同，从而造成巨大的寡糖定量 分析误差。rosati等发现，对于单抗，采用 native ms分析，在去除唾液酸前后，其定量 结果相同[4] 。这就证明，在native ms条件下， 唾液酸对单抗离子化效率没有影响， 可以得 到更为准确的定量结果。除避免了由于离子 化效率的影响， native ms不需要复杂的实验 操作，从而巨大地提高了实验的重现性和准 确度。此外，整个实验时间也大幅缩短，大 大提高了工作效率。在应用native ms对单抗 寡糖准确定量的背后，包含了native ms的简化图谱特点：native ms疏离的信号分布会降 低不同糖型信号间相互覆盖的可能性，高质 量的原始质谱数，是寡糖准确定性与定量的 保证。类似的应用还有难度更大的混合抗体 分析等[5] 。在natalie等人的工作中，采用以 orbitrap为基础的native ms分析15个单抗混合 物，并对其进行定量分析，最大定量分析误 差（标准差）仅为1.14%[5]
借用生物质谱领军人heck在2012年nature methods上的一段话作为结尾“我们相信，以 orbitrap质谱分析器为基础的非变性质谱法， 将会对结构生物学、生物化学、系统生物学、 蛋白相互作用网络研究，特别是生物药物表 征分析等多个领域产生巨大的影响”[3] 。
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